Sangeri sekveneerimine ja kapillaarelektroforees
Oleme alates 2006. aastast pakkunud erinevaid sekveneerimise ning genotüüpimise teenuseid. Meile teadaolevalt oleme Eestis ainus Sanger-tüüpi sekveneerimise teenusepakkuja.
Teenused jaotuvad kaheks - DNA sekveneerimise täisteenuseks ja kapillaarelektroforeesiks. Esimese puhul viime läbi sekveneerimisreaktsiooni ja sellele järgneva uurimismaterjali ettevalmistamise, teise puhul lähevad tellija poolt ette valmistatud materjalid otse analüsaatorisse.
Analüüse viime läbi Applied Biosystemsi kapillaarelektroforeesimasinatel.
NB! Sama päeva kiirteenuse tellimiseks peavad materjalid jõudma laborisse hiljemalt kl 9 hommikul. Riiklikel lühendatud tööpäevadel sama päeva kiirteenust ei osutata, tulemused saabuvad järgmise tööpäeva jooksul.
DNA sekveneerimise täisteenus
DNA sekveneerimise täisteenuse puhul saadab tellija meile oma uuritava PCR-i produkti või plasmiidi ning sekveneerimispraimerid (või valib praimeri meie poolt pakutavate universaalpraimerite hulgast). Meetodi põhimõttega saate tutvuda siin.
Sekveneerimist viime läbi kahe Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer masinaga.
- Saata matriits-DNA - plasmiidi puhul 300-500 ng reaktsiooni kohta, PCR-i produkti puhul 30-50 ng reaktsiooni kohta. Igas reaktsioonisegus saame kasutada kuni 5,7 μL DNA-d
- Saata praimerid - 10 μM (ehk 10 pmol/μL) kontsentratsiooniga praimerit kulub ühe reaktsiooni peale 0,3 μL (kuid palume saata mitte vähem kui 2-3 μL)
- Täita tellimisleht, saata aadressile [email protected], samuti trükkida välja ning pakkida proovidega kaasa.
Pakk DNA, praimerite ning tellimislehega saata:
TÜ GI tuumiklabor
Riia mnt 23b-302
51010 Tartu
Kui toote saadetise ise ära, siis ootame neid Riia maantee poolse valvuri juures olevasse külmkappi (kapp märgistatud sildiga "Sekveneerimine").
DNA proovid tuleb saata 200 μL plastikus - kas ühekaupa avatavate kaantega 8-kohalistes strippides või half-skirted PCR plaatides.
Praimereid eelistame saada 1,5 mL tuubides või 8-kohalistes 200 μL strippides.
Üksikplastikus (rohkem kui seitse tuubi) esitatud tellimustele võib lisanduda kuni 50% suurune käitlustasu.
Soovitame kasutada järgmisi või samaväärseid 8-kohalisi strippe:
- Eppendorf PCR Tube Strips, tootenumber 0030124359
- Nerbe Plus PCR Microcentrifuge Tube PP, tootenumber 04-032-0600
Proovide tuubid märgistada numbritega alustades ühest või muu lühikese identifikaatoriga. Märgistus peab kattuma saatelehe tulbaga "Märgistus tuubil". Kui ühe prooviga on vaja läbi viia mitu reaktsiooni, siis korrata saatelehel sama proovi märgistust. Tulemusfailide nimed moodustuvad saatelehe tulpadest "Proovi nimi" ja "Praimeri nimi".
Kui kasutate plaati, siis palun täitke see tulpade järgi A01, B01, C01 jne järjekorras. Plaadi märgistus peab olema plaadi küljel, mitte kattel.
| Praimer | Järjestus | Pikkus (ap) |
| ITS4 | TCCTCCGCTTATTGATATGC | 20 |
| ITS5 | GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG | 22 |
| M13F | GTAAAACGACGGCCAGT | 17 |
| M13F-pUC(-40) | GTTTTCCCAGTCACGAC | 17 |
| M13R | GCGGATAACAATTTCACACAGG | 22 |
| M13R-pUC(-40) | CAGGAAACAGCTATGAC | 17 |
| pJET1.2F | CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC | 23 |
| pJET1.2R | AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG | 24 |
| SP6 | ATTTAGGTGACACTATAG | 18 |
| T3 | ATTAACCCTCACTAAAG | 17 |
| T7 | AATACGACTCACTATAG | 17 |
| T7 promoter | TAATACGACTCACTATAGGG | 20 |
| T7 terminator | GCTAGTTATTGCTCAGCGG | 19 |
- Lisateenusena pakume PCR-i produktide ensümaatilist puhastamist, mida viime läbi Thermo Scientific FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase'i ja Exonuclease I-ga.
- Ühtlasi on võimalik tellida kiirteenust, mille puhul garanteeritakse Teile tulemuste kättesaamine järgmise tööpäeva jooksul. Kui soovite kiirtellimuse vastuseid sama tööpäeva jooksul, siis peavad proovid olema meieni jõudnud hiljemalt kell 9.00. Kiirteenuse tellimiseks tehke sellekohane märge saatelehe lahtrisse "Märkused".
- Samuti pakume keerulise matriitsi sekveneerimist, mida soovitame kasutada nukleotiidseid kordusi sisaldava, GC-rikka või sekundaarstruktuure moodustava materjali puhul. Keerulise sekveneerimise tellimiseks tehke sellekohane märge saatelehe lahtrisse "Märkused".
Kapillaarelektroforees
Kapillaarelektroforeesi viime läbi Applied Biosystems 3500xl Dx Genetic Analyzer masinaga.
1. Valmis reaktsioonide sekveneerimine
Sekveneerime ka teie poolt valmistatud reaktsiooniprodukte. Produktid peavad olema valmistatud kasutades BigDye® Terminator v3.1 (erandjuhul ja sellekohase märkega ka BigDye® Terminator v1.1) ensüümimiksi, puhastatud üleliigsetest praimeritest ja nukleotiididest ning suspendeeritud 10 μL formamiidis (70% formamiid või Applied Biosystemsi Hi-Di formamiid).
Tellimuse esitamiseks pole saatelehte vaja täita.
Saatke proovide nimekiri [email protected] aadressile *.txt failina, lisades juurde ka teenuse eest tasuja.
2. Fragmentanalüüs
Peale sekveneerimise viime läbi ka mikrosatelliitide analüüsi, MLPA analüüsi, genotüpeerimist (Applied Biosystems SNaPshot Multiplex System) jm.
Tellimuse esitamiseks pole saatelehte vaja täita, saatke proovide nimekiri [email protected] aadressile *.txt failina, lisades juurde ka teenuse eest tasuja ning kasutatud märgiste kombinatsioon.
Teenust saab tellida ka nii, et kasutate meie poolt pakutavat ROX 500, LIZ 500 või LIZ 1200 pikkusmarkerit.
Üldjuhul valmistab klient uuritava materjali ette kuni analüüsi läbiviimiseni, meie teostame vaid proovide denatureerimist vahetult enne analüüsi.
Võimalikud värvikombinatsioonid:
| Filter | Dye set | Sinine | Roheline | Kollane | Punane | Pikkusmarker |
|---|---|---|---|---|---|---|
| D | DS-30 | 6FAM | HEX | NED | ROX | |
| G5 | DS-33 | 6FAM | VIC | NED | PET | LIZ |
| E5 | DS-02 | dR110 | dR6G | dTAMRA | dROX | LIZ |
| 4Dye | Custom | 6FAM | HEX | TAMRA | ROX | |
| 5Dye | Custom | FL | JOE | TMR-ET | CXR-ET | WEN |
| F | Promega | FL | JOE | TMR | CXR |
NB! Pikkusmarker lisatakse igasse proovi. Fragmentanalüüsi proovide resuspendeerimisel tuleb kvaliteetse tulemuse saamiseks kasutada Applied Biosystemsi Hi-Di formamiidi.
Proovide arv ühes tellimuses peab jaguma 24-ga.
Fragmentanalüüsi meetodite laia valiku tõttu palume enne esimese tellimuse tegemist meiega aadressil [email protected] ühendust võtta, et plaanid läbi rääkida.
